Affy芯片

Affymetrix (昂飛)芯片平臺介紹

簡介： 
美國 Affymetrix 公司是基因芯片產業先行者，早在1989年就研制出了基因芯片。其開發的寡核苷酸原位光刻合成專利技術(light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays)，是目前高密度的芯片制備技術。Affymetrix 公司以其完備的芯片設計，穩定可靠的分析結果和強大的生物信息學分析能力，幫助研究人員在短時間內獲得大量可靠的結果，為后續研究提供重要的線索和幫助。Affymetrix GeneChip生物芯片檢測系統，是由高密度GeneChip芯片和試劑，雜交、掃描儀器，數據處理和分析工具組成的一整套檢測平臺，是經歐盟和美國FDA審批的可用作體外診斷的芯片系統。 
目前用Affymetrix芯片發表的科學文章現已多達3萬多篇文章，其中多篇文章發表在nature、science、 cell等學術刊物上。 
1. 基本原理： 
Affymetrix公司開發的寡聚核苷酸原位光刻專利技術，利用此技術用很少的步驟可合成大量的DNA陣列。 Affymetrix的原位合成技術可制作的點陣密度高達106~1010/cm2。首先使固相片基羥基化，并用光敏保護基團將其保護起來，然后選取適當的避光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。這樣，當光通過避光膜照射到支持物上時，受光部位的羥基就會發生脫保護而活化，從而可以反應結合堿基。由于參與合成的堿基單體一端可以進行固相合成，另一端受光敏基團的保護，所以原位合成后，可進行下一輪的光照、脫保護和固相合成。循環下去，不斷改變避光膜的透光位點，就可以實現在同一玻片上合成成千上萬種預定序列的寡核苷酸探針。 

2. 平臺展示：3. 技術優勢：
    基因芯片雜交的靈敏度和特異性是芯片技術的核心，Affymetrix在探討了各種各樣的影響因素后，設計出了一種獨特的PM-MM探針方案（見下圖）。芯片上的每一個基因或EST都是由一個或幾個探針組(probe set)組成，每組探針組又由11-20對25mer的探針對(probe pair)組成，每探針對包括兩個探針池(probe cell)，其中一個是完全匹配（Perfect-Match，PM）的，另外一個是序列中間有一個堿基錯配的(Mis-match, MM)。

3.1 特異性好： 
相比cDNA芯片和單一序列的寡核苷酸芯片，Affymetrix設計多個短的探針片段，可以有效的區分有同源性的基因序列，克服了背景噪聲、錯誤和偏差，避免了同源性靶序列與探針交叉雜交，而引起的假陽性和判斷錯誤。25mer長度的寡核苷酸的信號強度和分辨率達到了一個平衡，在這個長度下，有一個堿基發生錯配，雜交復合物就會變得很不穩定。如果長度達到60mer，就無法區分序列上十分接近的序列了。此外, 從多個探針位點檢測的熒光信號，經過綜合評估、統計計算和分析，獲得的數據比單個探針判斷樣品是否存在某一靶序列的數據更為可靠。 

3.2 靈敏度高： 
在PM-MM探針設計中，MM探針是有效的內參照，它們與PM探針一樣可以和非特異性序列結合，這樣，就可以將不同來源的樣品中的背景信號有效的定量扣除。這種獨特的設計對于區分特異性和非特異性雜交是相當靈敏的。比較那些單一的基因探針來說，PM-MM探針的高特異性和靈敏度更適合檢測低豐度表達的基因。如下圖，僅用PM探針與聯合應用PM-MM探針檢測靶序列的靈敏度比較 

如上圖所示，將已克隆的轉錄產物以不同的濃度摻入到組織樣品中，在組織樣品中是不含有原始的克隆轉錄產物的。經過標記的樣品與Affymetrix Genechip人類基因組芯片雜交，在克隆轉錄產物濃度低于8pM時，PM單獨探針無法探測出相應的濃度變化，而與MM探針聯合使用則可以探測出。PM-MM探針對的使用可以探測出的樣品中轉錄物的范圍為1:100,000-1:300,000。PM-MM探針對照設計可提高對復雜背景特異性檢測，使得靈敏度與特異性之間達到一個優化的平衡。
3.3 定量精確、重復性好： 
Affymetrix的基因芯片好的重復性使得某一樣品中基因表達的絕對水平是可靠的，還使得比較不同樣品之間各種基因表達的相對比例是可靠的，而雙色法需在每次雜交檢測中設置對照，只能進行兩個樣品之間的比較，芯片之間的比較并不可靠。Affymetrix進行多個樣品之間的比較時，只需在多個樣本中設置對照即可。
兩次制備的同一樣本，不同批次的芯片

不同芯片間、不同批次樣品間實驗結果吻合極好，保證了多張芯片間的比較的有效、可靠性。 
3.4 提供樣品質控：
    在總RNA提取及cRNA制備好后，分別進行分光光度計的量檢、變性膠電泳的質檢探針組設計可以了解到基因各個部位的信號值情況，其中3’,5’信號值比值作為判斷樣品RNA的完整性的指標在芯片結果報告中將給出相關數據。
    在雜交混合液中加入oligo B2 ，在芯片的掃描結果上如果可以清晰的看到四周、中心以及芯片名稱的圖樣，證明芯片的各項常規參數正常。
    通過芯片上的看家基因對芯片質量進行評定通過參入對照基因bioB，bioc，bioD and cre對芯片的靈敏度進行評定
    加入對照基因bioB，bioc，bioD and cre除了可以質控芯片的靈敏度外他們還是雜交、洗滌、掃描過程的質檢標準。
    另外儀器本身還規定有一定的噪音值背景值質控儀器的運轉。 
4. 操作流程： 
4.1 總RNA純化； 
4.2 由RNA合成雙鏈； 
4.3 生物素cRNA合成； 
4.4 片段化； 
4.5 雜交、洗滌、染色、掃描芯片； 
5. 應用服務： 
Affymetrix公司芯片產品非常豐富，目前可以提供生命科學研究和醫學研究的二十多種生物物種的全基因組表達譜芯片，以及十幾種模式植物、農作物以及微生物全基因組表達譜芯片。 
基因表達研究方面，GeneChip芯片被業界廣泛采用，可研究的物種十分豐富，廣泛用于發現新的信號通路、疾病分型、驗證藥物作用位點、證明作用機制、分 析毒性反應等多個領域。Affymetrix全面分析人、小鼠、大鼠全部Exon表達的基因芯片，用于分析同一個基因不同轉錄產物；推出人、小 鼠、酵母菌、線蟲、果蠅的Tiling芯片，可用于分析基因組DNA上所有可以被轉錄的部分，發現新轉錄本，掃描基因組甲基化修飾位點，染色質修飾位點等。 
在DNA研究方面，GeneChip芯片同樣有著不俗成績，SNP分型芯片在全基因組掃描、腫瘤基因組學、致病基因分型和藥代動力學相關基因分型方面得到廣泛應用。另外高密度的重測序芯片使得特定區域的基因序列分析成為可能。 
Affymetrix公司的基因芯片產品在世界范圍內已廣泛應用于人類疾病的分子機理、腫瘤分型、藥物篩選、免疫學、信號轉導、基因調控、細胞周期與凋亡、藥物代謝與毒理、神經發育與分化、SNP分析、細菌基因組研究以及植物基因調控等各個方向，并取得了巨大的成功。 
Affymetrix 公司芯片在目前的公共數據庫（如GEO）中積累了大量數據結果，和其他的生物芯片平臺相比，Affymetrix芯片平臺能夠提供更大量的比較數據以滿足 生物信號通路分析和目標靶分子等深入研究的需要。同時，豐富的商業軟件和免費軟件為Affymetrix芯片系統構建了相應分析平臺，使得個性化數據分析 成為可能，也大大促進了實驗結果的交流。
   上海邃志生物科技有限公司擁有Affymetrix公司的多套芯片分析平臺：GeneChip 3000 Target Genotyping System,配備有4通道掃描的Scanner 30007Gplus和可滿足大規?；蚪M篩查的自動裝片機，適合Affymetrix所推出的任何種類的芯片，可為您提供Affymetrix公司的 GeneChip系列產品包括：
⑴ 人全基因組表達譜芯片
⑵ 小鼠、大鼠等動物全基因組表達譜芯片
⑶ 水稻、擬南芥等植物表達譜芯片
⑷ 人SNP6.0分析芯片
⑸ 人Tilling全基因組掃描芯片
⑹ 外顯子芯片
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