甲基化檢測

 MassARRAY飛行時間質譜平臺甲基化檢測

簡介： 
    DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉變為5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。脊椎動物DNA的甲基化狀態與生長發育調控密切相關，比如在腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，導致抑癌基因表達的下降。 
DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用。 
MassARRAY 分子量陣列基因分析系統EpiTYPER DNA甲基化分析技術結合了堿基特異性酶切反應和MALDI-TOF測序原理。兩者的完美結合使得該技術成為高準確性、高通量及高靈敏度的DNA甲基化定量分析手段。 
MassARRAY分子量陣列基因分析系統EpiTYPER DNA甲基化分析技術是高通量DNA甲基化定量技術。實現多重CpG的甲基化位點的定位定量檢測。配套的EpiTYPER軟件為用戶提供便捷的數據分析和報告工具。 
1. 基本原理： 
1.1 飛行時間質譜原理： 
質譜儀簡單來說就是把不同的分子按照分子量進行排序的儀器。 
我們的質譜是Maldi-Tof質譜，全稱是基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜。將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管 , 而后用瞬時納秒 (10-9s) 強激光激發，由于基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，核酸分子就會解吸附并轉變為亞穩態離子，產生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能，進而在一非電場漂移區內按照其質荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達檢測器。MALDI產生的離子常用飛行時間（Time-of-Flight,TOF）檢測器來檢測，不同分子量的分子飛行時間也不同，分子量越大飛行時間越長，根據飛行時間進而判斷分子量大小。通過對物質的分子量進行檢測，達到區分、鑒別物質的目的。 
1.2 利用飛行時間質譜檢測甲基化原理： 
實驗從亞硫酸鹽處理待測DNA開始。經過亞硫酸鹽處理DNA中的未甲基化的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），由此在DNA模板中產生了甲基化特異的序列變化。利用5末端帶有T7-啟動子的引物進行PCR擴增。產物經蝦堿性磷酸酶（SAP）處理后用于堿基特異性的酶切反應。酶切后DNA片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化。配套軟件EpiTYPER則能提供數字和圖像注釋工具，能將實驗數據與客戶提供的DNA序列相吻合。作為內在的質量控制機制，該系統還包括了基本統計學分析方法及數據可靠程度的評估手段，自動報告每個相應片段的甲基化程度。 
 
上圖：甲基化檢測原理圖 
 
上圖：甲基化程度質譜原始圖 
2. 平臺展示： 
  
3. 其他DNA甲基化檢測技術對比： 
3.1 高效液相色譜 (HPLC)： 
HPLC是一種比較傳統的方法，是根據DNA或蛋白分子量和構象的不同而使其加以分離。由于在動態相和靜態相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統的壓強的增加，其分辨率增高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲基化水平。過程是將DNA樣品先經鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算單位面積就得到基因組整體的甲基化水平。這是一種檢測DNA甲基化水平的標準方法。 
儀器：高效液相色譜儀； 
優勢：操作簡單； 
劣勢：只能測算到基因組的甲基化程度、不準確、不能對甲基化位點定位。 
3.2 甲基化敏感性限制性內切酶PCR法(MSRE-PCR)： 
這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后，進行PCR擴增和產物分離，明確甲基化狀態再進行分析，常使用的甲基化敏感的限制性內切酶。 
儀器：PCR儀、凝膠成像系統； 
優勢：操作簡單、成本較低； 
劣勢：酶要求高、不準確、不能對甲基化位點定位、重現性差、通量低。 
3.3 重亞硫酸鹽測序法 (Bisulphite Sequencing)： 
該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，進行PCR擴增所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后，對PCR產物進行測序并且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。 
儀器：PCR儀、測序儀； 
優勢：準確度高、能給甲基化位點精確定位、可重復性高； 
劣勢：需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴，通量低。 
3.4 甲基化特異性的PCR (MS-PCR)： 
該方法中DNA先用重亞硫酸鹽處理，隨后行引物特異性的PCR。其設計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結合處理后的甲基化DNA鏈，另一對結合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測MS-PCR擴增產物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。 
儀器：PCR儀、凝膠成像系統； 
優勢：操作簡單、成本較低； 
劣勢：不準確、甲基化位點不能定位、通量低。 
3.5 TaqMan探針法： 
結合重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5’端連接報告熒光，3’端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平。 
儀器：實時熒光PCR儀； 
優點：準確度高、可重復性高、高效、需樣量少； 
    缺點：TAqman探針成本高，分析結果本底較高，通量低。 
3.6 芯片法： 
        是由高密度GeneChip芯片和試劑，雜交、掃描儀器，數據處理和分析工具組成的一整套檢測平臺，芯片可設計到覆蓋大多數CpG島，并根據需求加入了CpG島以外的CpG位點。 
        儀器：Affymetrix基因芯片平臺； 
        優點：準確度高、通量極高、高效； 
        劣勢：儀器昂貴，小批量成本高。 
3. 技術優勢： 
3.1高性能： 
能夠分析覆蓋長達600bp內的多個CpG位點，能夠分析福爾馬林處理的石蠟組織，無需任何熒光標記； 
3.2高準確性： 
準確地進行甲基化定量從10%到90%，標準差只有5% ，不同實驗室的實驗結果可比性強、可重復性高； 
3.3高性價比： 
用384孔板進行PCR反應，反應容積小節省試劑，一個擴增產物可以進行多個CpG位點分析。 
3.4操作簡單： 
無需設計CpG位點特異性引物，無需進行PCR產物純化，研究幾個到幾百個甲基化位點的理想手段，全自動標準化軟件和數據報告形式使不同樣本的比較簡便易行。 
4. 操作流程： 
4.1 客戶提供DNA或者各類生物樣本； 
4.2 樣本完整性檢測以及前處理(抽提和質檢)； 
4.3 用亞硫酸鹽處理DNA，使未甲基化的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），由此在DNA模板中產生了甲基化特異的序列變化； 
4.4 利用5末端帶有T7-啟動子的引物進行PCR擴增； 
4.5 產物經蝦堿性磷酸酶（SAP）處理后用于堿基特異性的酶切反應； 
4.6 點樣； 
4.7 利用配套軟件EpiTYPER自動報告每個相應片段的甲基化程度； 
4.8 分析報告。 
5. 應用服務： 
5.1 研究遺傳性疾病與甲基化相關基因異常的關系 
某些遺傳性疾病的發生與相關基因甲基化異常及甲基化程度有關； 
5.2 疾病機制研究 
        通過甲基化位點及程度了解掌握疾病發生、調控機制研究； 
5.3 甲基化在癌癥發生中的作用 
在腫瘤細胞中，異常甲基化最大的特點是全基因組的低甲基化和局部性(CpG島)高甲基化并存 ，這既是癌癥發生的重要原因之一，也是癌癥良惡轉化的重要標志。一般認為，癌癥發生的機制主要包括癌基因的活化和抑癌基因的失活，目前發現二者都與基因甲基化異常有關。已發現大量的腫瘤細胞中抑癌基因的失活與該基因啟動子區域的CpG島高甲基化有直接關聯； 
5.4 甲基化在癌癥發展中的作用 
在癌癥的發展中，甲基化的狀態并非一成不變。癌細胞內的全基因組的低甲基化程度與疾病進展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關系 ，腫瘤細胞DNA的總體甲基化的程度越低，癌癥的惡性程度也就越大。而CpG島的局部高甲基化的趨勢也隨腫瘤的進展而向周圍擴展 。由于不同癌細胞甲基化進展的程度不同，這成為癌組織異質性的重要原因之一 ； 
5.5 甲基化的診斷對病情預測的和治療 
由于CpG島的局部高甲基化的出現往往早于細胞的惡性增生，因而可用于腫瘤發生的早期預測。全基因組的低甲基化也伴隨癌癥的發生而出現，且隨著惡性程度的增加而更加明顯 ，所以它也是診斷病情的重要指標之一。甲基化技術還是腫瘤類型鑒別診斷的輔助手段，可用于癌癥發生中的特異性失活抑癌基因的檢測 。除可進行診斷外，甲基化的狀態還可預測患者治療的預后情況。如在肝細胞肝癌中，甲基化的總數目可作為一個獨立的診斷指標，用于預測患者的生存率 ；腫瘤中，伴隨誘導凋亡的基因基本上都發生甲基化； 
5.6 藥物開發 
在近年發展中，去甲基化藥物在治療癌癥中的前景更加令人注目。通過重新激活被甲基化失活的抑癌基因，可阻止癌癥進一步的發生發展，甚至逆轉或殺死腫瘤細胞。但目前去甲基化的藥物較少，因此對甲基化藥物的臨床研究有廣闊的前景。 
5.7 發育生物學、干細胞分化的研究 
     甲基化位點及程度影響了干細胞分化的方向，同時也對細胞凋亡起了很重要的作用，對甲基化的研究可以作為一個很好的基礎研究工具。